淺析中藥清除羥自由基實(shí)驗(yàn)的改良

添加日期：2010年5月8日 閱讀：1273

　　 機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生多種自由基，包括超氧陰離子自由基（O-2·）、羥自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化學(xué)性質(zhì)*活潑。一定數(shù)量的氧自由基可為機(jī)體所用，但過多的氧自由基將作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾�。�1～4］。因此，自由基清除劑的合成及尋找成為當(dāng)前醫(yī)藥研究的主要方向之一，而中藥的**、豐富及低毒更受人們的青睞。目前人們測定自由基清除劑清除羥自由基的方法有很多，其中鄰二氮菲- Fe2+氧化法操作簡單，設(shè)備要求不高，易于推廣和應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)對該方法進(jìn)行了若干改良。
　　1  材料與方法
　　1.1  試劑維生素C（鄭州羚銳制藥有限公司生產(chǎn)）、鄰二氮菲（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）、硫酸亞鐵銨（廣東光華化學(xué)廠有限公司生產(chǎn)，分析純）、過氧化氫（廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)，分析純）、磷酸二氫鉀（上海市國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、無水乙醇和氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）。
　　1.2  儀器752N紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），DK-600S三用恒溫水浴箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）。
　　1.3  方法以維生素C作為自由基清除劑，用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH。H2O2/Fe2+體系產(chǎn)生的·OH將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，使鄰二氮菲-Fe2+對536 nm波長的*大吸收減弱，A536明顯降低。當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，此氧化過程受抑制，A536則降低不明顯，并可通過A536值比較·OH清除劑的清除能力［5］。對該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)方面的改良：一是將反應(yīng)環(huán)境由pH 7.4改為pH 4.5的酸性環(huán)境；二是將37℃保溫時(shí)間由60 min改為30 min；三是測定吸光度的波長由536 nm改為510 nm。實(shí)驗(yàn)過程中分別在pH 7.4的磷酸緩沖液及pH 4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液的環(huán)境下進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)；在保溫5～60 min的時(shí)間范圍內(nèi)、536 nm和510 nm波長分別測定吸光度，比較兩種pH條件下吸光度的差異。反應(yīng)中依次加入鄰二氮菲、緩沖液、自由基清除劑維生素C、Fe2+及H2O2為加藥管；不加維生素C為氧化管；不加維生素C及H2O2為對照管。
　　1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示。
　　2  結(jié)果
　　2.1  不同測定波長及不同pH環(huán)境下的比較從表1可以看出，鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物的*大吸收波長為510 nm，而*佳酸堿環(huán)境為pH 4.5。表1  不同測定波長及不同pH環(huán)境下的比較(略）
　　2.2 不同保溫時(shí)間及不同pH環(huán)境下的比較圖1顯示了pH 7.4時(shí)不同保溫時(shí)間對A510的影響，對照管吸光度于15 min時(shí)達(dá)高峰，隨后緩慢下降；而加藥管和氧化管吸光度一開始便呈現(xiàn)急劇下降的趨勢。圖2顯示了pH 4.5時(shí)不同保溫時(shí)間對A510的影響，對照管吸光度于30 min時(shí)達(dá)高峰，此后處于基本穩(wěn)定狀態(tài)；加藥管和氧化管吸光度均于30 min后才出現(xiàn)較明顯的下降。
　　2.3  各管之間吸光度的變化值（ΔA）比較從表2可以看出，隨著保溫時(shí)間的**，各管之間的ΔA逐漸加大，但pH 4.5時(shí)的ΔA加藥管-氧化管，在30 min時(shí)*大，此后較為穩(wěn)定。表2  各管之間吸光度的變化值（ΔA）比較（略）
　　3 討論
    實(shí)驗(yàn)表明，鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物在酸性條件下（pH 4.5）比較穩(wěn)定，有較高的吸光度，并且*大吸收波長為510nm。而保溫時(shí)間也是實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，保溫到某一時(shí)間時(shí)，各管的吸光度較大，同時(shí)各管之間的吸光度變化值（ΔA）也較大，有利于自由基清除劑的甑選。從實(shí)驗(yàn)中觀察到，在pH 4.5的條件下，對照管保溫到30 min有*大的吸收峰，加藥管也有較大的吸光度，使加藥管與氧化管之間ΔA（ΔA加藥管-氧化管）達(dá)到*大，該值更能說明自由基清除劑的作用強(qiáng)弱，是判斷自由基清除劑的重要指標(biāo)，并且還能反映該方法的靈敏度。而在pH 7.4時(shí)，加藥管和氧化管一開始便呈現(xiàn)急劇下降的趨勢，雖然兩管吸光度有所差異，但ΔA加藥管-氧化管較pH 4.5時(shí)要小得多，不具有說服力，也降低了反應(yīng)的靈敏度。綜上所述，采用鄰二氮菲- Fe2+氧化法衡量自由基清除劑的作用時(shí)，*佳反應(yīng)條件為pH 4.5，測定波長為510 nm，37℃保溫時(shí)間為30 min。
        責(zé)任編輯：小季     4077222.com    2010-5-8 18:47:50

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